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<!DOCTYPE html>

<title>CRISPR/Cas12b-Methode</title>

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<h1 id="firstHeading" class="firstHeading mw-first-heading"><span class="mw-page-title-main">CRISPR/Cas12b-Methode</span></h1>

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</div>

<div id="mw-content-text" class="mw-body-content mw-content-ltr" lang="de" dir="ltr"><div class="mw-content-ltr mw-parser-output" lang="de" dir="ltr"><p>Die <b>CRISPR/Cas12b-Methode</b> ist eine biochemische Methode um <a href="../DNA" class="mw-redirect" title="DNA">DNA</a> zu schneiden. Sie ist eine Variante der <a href="../CRISPR/Cas-Methode" title="CRISPR/Cas-Methode">CRISPR/Cas-Methode</a> unter Verwendung der <a href="../Endonuklease" title="Endonuklease">Endonuklease</a> <a href="../Cas12b" title="Cas12b">Cas12b</a>.

</p>

<div class="mw-heading mw-heading2"><h2 id="Prinzip">Prinzip</h2></div>

<p>Cas12b (alter Name <i>C2c1</i>, ein Cas des Typs V, Klasse II) bindet wie andere Cas-Proteine (<a href="../Cas9" title="Cas9">Cas9</a>, <a href="../Cpf1" title="Cpf1">Cpf1</a>) eine <a href="../RNA" class="mw-redirect" title="RNA">RNA</a> mit einer <i>crRNA repeat</i>-Sequenz und einer <i>crRNA spacer</i>-Sequenz und schneidet in der unmittelbaren Umgebung doppelsträngige <a href="../DNA" class="mw-redirect" title="DNA">DNA</a> unter Erzeugung eines <i><a href="../Sticky_end" class="mw-redirect" title="Sticky end">sticky end</a></i>-<a href="../Doppelstrangbruch" class="mw-redirect" title="Doppelstrangbruch">Doppelstrangbruchs</a>. Weitere notwendige Faktoren sind das Vorhandensein einer <a href="../TracrRNA" class="mw-redirect" title="TracrRNA">tracrRNA</a> und ein <a href="../Protospacer_Adjacent_Motif" title="Protospacer Adjacent Motif">Protospacer Adjacent Motif</a> (PAM) in der zu schneidenden Ziel-DNA. Die auf die von Cas12b gebundene <i>crRNA repeat</i>-Sequenz folgende <i>crRNA spacer</i>-Sequenz bindet an die Ziel-DNA.

</p>

<div class="mw-heading mw-heading2"><h2 id="Typen">Typen</h2></div>

<p>Cas12b aus <i><a href="../Alicyclobacillus_acidoterrestris" title="Alicyclobacillus acidoterrestris">Alicyclobacillus acidoterrestris</a></i>, abgekürzt AacCas12b, besteht aus 1129 <a href="../Aminos%C3%A4uren" title="Aminosäuren">Aminosäuren</a> und bindet an eine PAM der Sequenz TTN in der Ziel-DNA.<sup id="cite_ref-uniprot-072_1-0" class="reference"><a href="#cite_note-uniprot-072-1"><span class="cite-bracket">[</span>1<span class="cite-bracket">]</span></a></sup> Der Schnitt der Ziel-DNA erzeugt einen <i><a href="../Sticky_end" class="mw-redirect" title="Sticky end">sticky end</a></i> mit einem 5′-Überhang von 6–8 Nukleotiden 14–17 Nukleotide strangabwärts vom PAM auf dem <i>non-target</i>-Strang bzw. 23–24 Nukleotide strangabwärts vom PAM auf dem <i>target</i>-Strang.<sup id="cite_ref-uniprot-072_1-1" class="reference"><a href="#cite_note-uniprot-072-1"><span class="cite-bracket">[</span>1<span class="cite-bracket">]</span></a></sup> Cas12b schneidet DNA bei einer Temperatur zwischen 37 und 60 °C,<sup id="cite_ref-uniprot-072_1-2" class="reference"><a href="#cite_note-uniprot-072-1"><span class="cite-bracket">[</span>1<span class="cite-bracket">]</span></a></sup> das Temperatur-Optimum liegt bei 48 °C.<sup id="cite_ref-2" class="reference"><a href="#cite_note-2"><span class="cite-bracket">[</span>2<span class="cite-bracket">]</span></a></sup> Bei 37 °C ist die <a href="../Enzymaktivit%C3%A4t" class="mw-redirect" title="Enzymaktivität">Enzymaktivität</a> vergleichsweise gering.<sup id="cite_ref-Strecker_3-0" class="reference"><a href="#cite_note-Strecker-3"><span class="cite-bracket">[</span>3<span class="cite-bracket">]</span></a></sup> Im Vergleich zu Cas9 oder Cpf1 (synonym Cas12a) erzeugt Cas12b weniger unspezifische Schnitte.<sup id="cite_ref-4" class="reference"><a href="#cite_note-4"><span class="cite-bracket">[</span>4<span class="cite-bracket">]</span></a></sup>

</p><p>Cas12b aus <i>Bacillus hisashii</i>, abgekürzt BhCas12b, ist mit 1108 Aminosäuren kleiner als SpCas9 (1368 Aminosäuren) und hat daher auch ein kleineres Gen, was die Verwendung in <a href="../Viraler_Vektor" title="Viraler Vektor">viralen Vektoren</a> (insbesondere <a href="../Adeno-assoziiertes_Virus" class="mw-redirect" title="Adeno-assoziiertes Virus">AAV-Vektoren</a>) erleichtert.<sup id="cite_ref-Strecker_3-1" class="reference"><a href="#cite_note-Strecker-3"><span class="cite-bracket">[</span>3<span class="cite-bracket">]</span></a></sup> Eine Verkürzung einer <i>sgRNA</i> um fünf Nukleotide am 5′-Ende verdreißigfacht die Enzymaktivität.<sup id="cite_ref-Strecker_3-2" class="reference"><a href="#cite_note-Strecker-3"><span class="cite-bracket">[</span>3<span class="cite-bracket">]</span></a></sup> Allerdings erzeugt der <a href="../Wildtyp" title="Wildtyp">Wildtyp</a> von BhCas12b bei 37 °C nur <a href="../Einzelstrangbruch" class="mw-redirect" title="Einzelstrangbruch">Einzelstrangbrüche</a>.<sup id="cite_ref-Strecker_3-3" class="reference"><a href="#cite_note-Strecker-3"><span class="cite-bracket">[</span>3<span class="cite-bracket">]</span></a></sup> Daher wurde eine Mutante von BhCas12b namens BhCas12b v4 entwickelt (K846R/S893R/E837G), die auch bei der Körpertemperatur von Säugetieren Doppelstrangbrüche und weniger unspezifische Schnitte erzeugt.<sup id="cite_ref-Strecker_3-4" class="reference"><a href="#cite_note-Strecker-3"><span class="cite-bracket">[</span>3<span class="cite-bracket">]</span></a></sup>

</p>

<div class="mw-heading mw-heading2"><h2 id="Einzelnachweise">Einzelnachweise</h2></div>

<li id="cite_note-uniprot-072-1"><span class="mw-cite-backlink">↑ <sup><a href="#cite_ref-uniprot-072_1-0">a</a></sup> <sup><a href="#cite_ref-uniprot-072_1-1">b</a></sup> <sup><a href="#cite_ref-uniprot-072_1-2">c</a></sup></span> <span class="reference-text"><a href="../UniProt" title="UniProt">UniProt</a> <a rel="nofollow" class="external text" href="https://www.uniprot.org/uniprotkb/T0D7A2">T0D7A2</a>: cas12b - CRISPR-associated endonuclease Cas12b - Alicyclobacillus acidoterrestris (strain ATCC 49025 / DSM 3922 / CIP 106132 / NCIMB 13137 / GD3B) - cas12b gene (uniprot.org) (englisch) 16. Oktober 2013, 24. Januar 2019</span>

</li>

<li id="cite_note-2"><span class="mw-cite-backlink"><a href="#cite_ref-2">↑</a></span> <span class="reference-text">S. Shmakov, O. O. Abudayyeh, K. S. Makarova, Y. I. Wolf, J. S. Gootenberg, E. Semenova, L. Minakhin, J. Joung, S. Konermann, K. Severinov, F. Zhang, E. V. Koonin: <i>Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems.</i> In: <i>Molecular cell.</i> Band 60, Nummer 3, November 2015, S. 385–397, <a href="../Digital_Object_Identifier" title="Digital Object Identifier">doi</a>:<span class="uri-handle" style="white-space:nowrap"><a rel="nofollow" class="external text" href="https://doi.org/10.1016/j.molcel.2015.10.008">10.1016/j.molcel.2015.10.008</a></span>, <a class="external mw-magiclink-pmid" rel="nofollow" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26593719?dopt=Abstract">PMID 26593719</a>, <a rel="nofollow" class="external text" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4660269/">PMC 4660269</a> (freier Volltext).</span>

</li>

<li id="cite_note-Strecker-3"><span class="mw-cite-backlink">↑ <sup><a href="#cite_ref-Strecker_3-0">a</a></sup> <sup><a href="#cite_ref-Strecker_3-1">b</a></sup> <sup><a href="#cite_ref-Strecker_3-2">c</a></sup> <sup><a href="#cite_ref-Strecker_3-3">d</a></sup> <sup><a href="#cite_ref-Strecker_3-4">e</a></sup></span> <span class="reference-text">Jonathan Strecker, Sara Jones, Balwina Koopal, <a href="../Jonathan_Schmid-Burgk" title="Jonathan Schmid-Burgk">Jonathan Schmid-Burgk</a>, Bernd Zetsche, Linyi Gao, Kira S. Makarova, Eugene V. Koonin & Feng Zhang: <i>Engineering of CRISPR-Cas12b for human genome editing.</i> In: <i><a href="../Nature_Communications" title="Nature Communications">Nature Communications</a>.</i> Band 10, Nummer 1, Januar 2019, S. 212, <a href="../Digital_Object_Identifier" title="Digital Object Identifier">doi</a>:<span class="uri-handle" style="white-space:nowrap"><a rel="nofollow" class="external text" href="https://doi.org/10.1038/s41467-018-08224-4">10.1038/s41467-018-08224-4</a></span>, <a class="external mw-magiclink-pmid" rel="nofollow" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30670702?dopt=Abstract">PMID 30670702</a>.</span>

</li>

<li id="cite_note-4"><span class="mw-cite-backlink"><a href="#cite_ref-4">↑</a></span> <span class="reference-text">L. Liu, P. Chen, M. Wang, X. Li, J. Wang, M. Yin, Y. Wang: <i>C2c1-sgRNA Complex Structure Reveals RNA-Guided DNA Cleavage Mechanism.</i> In: <i>Molecular cell.</i> Band 65, Nummer 2, Januar 2017, S. 310–322, <a href="../Digital_Object_Identifier" title="Digital Object Identifier">doi</a>:<span class="uri-handle" style="white-space:nowrap"><a rel="nofollow" class="external text" href="https://doi.org/10.1016/j.molcel.2016.11.040">10.1016/j.molcel.2016.11.040</a></span>, <a class="external mw-magiclink-pmid" rel="nofollow" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27989439?dopt=Abstract">PMID 27989439</a>.</span>

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